© Salk Institute
Nach dem hierarchischen Modell windet sich die Doppelhelix zunächst in regelmäßigen Abständen um Histone und bildet primäre, 11 Nanometer breite DNA-Core-Nukleosomen. Diese Perlenschnur-artigen Polymere finden sich zu dickeren (30 nm) Strukturen zusammen, aus denen wiederum noch dickere (120 nm) Chromonema entstehen. Ordentlich aufeinandergestapelt formieren diese 300 bis 700 nm dicke Chromatide die letztendlich mitotische Chromosomen bilden.
Ein Team um den Imaging-Spezialisten Mark Ellisman von der University of California, San Diego und der Chromatin-Struktur Forscherin Clodagh O’Shea vom Salk Institute in La Jolla, Kalifornien zeigt in ihrem jüngsten Science Paper, dass DNA in vivo (humane U20S-Zellen) weit weniger ordentlich verpackt vorliegt. Um dies experimentell nachzuweisen, kombinierten die Forscher die elektronenmikroskopische Tomographie (EMT) mit der ChromEM-Färbemethode und entwickelte hieraus das ChromEMT-Verfahren.
Schon seit den 1980er Jahren stießen Wissenschaftler bei EM-Tomographie-, Röntgenstreu- und Elektronenmikroskopie-Experimenten zum hierarchischen Modell immer wieder auf Unstimmigkeiten. Allerdings standen bei diesen Methoden ungenügende Signalstärken, Artefakt verursachende Vorbehandlungen sowie andere Hürden einer systematischen, verlässlichen Strukturanalyse im Weg. Ein wesentliches Problem bei der In situ-Untersuchung der Chromatin-Ultrastruktur mit elektronenmikroskopischen Verfahren sind die hierzu eingesetzten konventionellen EM-Farbstoffe, wie Osmiumtetroxid (OsO4), die meist stärker an Lipide, Proteine oder RNA binden als an DNA.
Die Lösung dieses Problems fanden die amerikanischen Forscher schließlich in dem eigentümlichen Verhalten einiger Fluorophore. Diese fallen nach Anregung und entsprechender Photonenemission nicht einfach in den Grundzustand zurück, sondern durchlaufen ein sogenanntes Intersystem Crossing. Dabei generieren sie reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die sich mit Diaminobenzidin (DAB) lokal „auffangen“ lassen. ROS-oxidiertes DAB präzipitiert und kann mit OsO4 aufgespürt werden. Die im Elektronenmikroskopie-Bild erscheinenden OsO4-Signale liefern schließlich die nötigen Informationen zur Lokalisation und Dichte der mit dem Fluorophor markierten DNA.
Bei einem Screening diverser DNA-Farbstoffe durch das kalifornische Team blieb als einziger geeigneter Kandidat für die ChromEMT-Technik DRAQ5 (Deep Red Fluorescing Anthraquinone 5) übrig. Für das Screening kamen nur langwellig-anregbare Farbstoffe infrage, da DAB bei etwa 400 nm von selbst polymerisiert und somit reichlich lästigen „Staub“ verursachen würde. Das Fluoreszenzverhalten von DRAQ5 ändert sich bei einer etwaigen Proben-Vorbehandlung mit Glutaraldehyd nicht, die Fixierung der Zellen ist daher kein Problem.
Die Handgriffe und Geräteanforderungen beim ChromEMT ähneln denen gängiger Färbe- und EM-Methoden: Zunächst werden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und dann zur DNA-Anfärbung mit DRAQ5 inkubiert. Nach Anregung bei 620 nm löst der Fluoreszenzfarbstoff DRAQ5 die Photooxidation des ebenfalls anwesenden DAB aus. Dies dauert nur wenige Minuten und geschieht ausschließlich in den vom anregenden Licht getroffenen Zonen.
Für hochauflösende Aufnahmen färbt man die Zellen mit OsO4 an, dehydriert sie mit Ethanol und bettet sie in Harz ein. Aus den eingebetteten Proben lassen sich Dünnschnitte von 70 bis 80 nm Dicke für die Transmissions-Elektronenmikroskopie anfertigen.
Sammelt man tomographische Aufnahmen von Proben in Harzblöcken, die sukzessive um wenige Grad gedreht wurden, so lassen sich hieraus dreidimensionale Bilder rekonstruieren. Deren Auflösung ist hoch genug, um die Feinstruktur der Chromosomen zu erkennen. Hochauflösende dreidimensionale Strukturinformationen erhielten die Forscher, indem sie knapp tausend tomographische Aufnahmen zu einem Gesamtbild zusammenführten.
Mit dem ChromEMT-Verfahren visualisierte die Gruppe um Ellisman und O’Shea die tatsächliche Ultrastruktur von Chromatin in intakten Zellen. Demnach bildet Chromatin eine 5 bis 24 nm dicke Kette, die unterschiedlich dicht zusammengepresst ist (quantifizierbar als Chromatin Volume Concentration, CVC). Diese eher ungeordneten und dennoch kompakten Strukturen finden sich im Kern menschlicher Zellen sowohl in der Interphase als auch während der Mitose. In vitro sieht Chromatin viel ordentlicher aus, doch diese Ordnung forciert der Experimentator: Isolierte Zellkerne oder Zellen sortieren ihr Chromatin offensichtlich um, was die Forscher lange Zeit in die Irre führte.
Andrea Pitzschke