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Die Aufgaben in dem interdisziplinären Forscherteam aus Karlsruhe sind ziemlich klar verteilt: Der Physiker ist federführend für die Optimierung des Laserdrucks, der Chemiker entwickelt die Tinte respektive die passenden Fotolacke und der Biologe züchtet die Zellen auf den gedruckten Mikrogerüsten in einem Milieu das der Natur möglichst nahe kommt.
Die 3D-Drucktechnik des Trios basiert auf dem direkten Laserschreib-Verfahren (DLW) bei dem (Meth)acrylat-Monomere photochemisch polymerisiert werden (Zwei-Photonen-Polymerisation). Die Tinte wird hierbei auf einen Träger gesprüht, mit einem Laserstrahl gezielt ausgehärtet und an den nicht belichteten Stellen ausgewaschen.
Mit (Meth)acrylaten alleine ist es jedoch schwierig, ein dreidimensionales Gerüst mit einer funktionalisierten Oberfläche aufzubauen, die das Wachstum der kultivierten Zellen unterstützt. Hierzu sind reaktive Gruppen an den Gerüstbausteinen nötig, die sich mit entsprechenden Reaktionen modifizieren lassen.
Zunächst experimentierten die Forscher mit zweistufigen Methoden zur Funktionalisierung der Oberfläche. Diese waren jedoch sehr zeitaufwändig und erforderten einen speziellen Laser. Auch Modifikationen des Fotolacks brachten keinen entscheidenden Durchbruch.
Also änderte die Gruppe ihre Strategie und versah bereits die (Meth)acrylat-Monomere mit reaktiven Gruppen, die den Belichtungsprozess unbeschadet überstehen und sich in orthogonaler Richtung funktionalisieren lassen (Claus et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 3817-22).
Dazu mischte die Gruppe einen Netzwerkbildner auf Acrylat-Basis und einen Photoinitiator mit den reaktiven Monomeren Phenacylsulfid und Photoenol. Anschließend errichtete sie mit der DLW-Technik das Acrylat-Grundgerüst auf einem Deckglas mit silanisierter Oberfläche. In den weiteren Schritten vernetzten die Forscher die reaktiven Phenacylsulfid sowie Photoenol-Monomere mit dem DLW-Verfahren und erhielten hierdurch dreidimensionale Mikrogerüste (Scaffolds).
Die gedruckten Gerüste untersuchte das Trio mittels Sekundärelektronenmikroskopie. Es zeigte sich schnell, dass sie die gewünschten klar definierten Mikrostrukturen mit homogener Oberfläche aufwiesen. Um zu testen ob sich die Oberflächen funktionalisieren ließen, gaben die Forscher eine Lösung mit Thiol-, Amin- und Dien-Gruppen sowie Maleinimid auf das Gerüst und bestrahlten es mit UV-Licht, um die entsprechenden Reaktionen zu induzieren. Die funktionalisierten Gerüste untersuchten sie schließlich mittels Time-of-Flight Sekundärionen Massenspektrometrie (ToF-SIMS). Die MS-Experimente bestätigten die erwarteten räumlichen Strukturen sowie die erfolgten Funktionalisierungs-Reaktionen. Zudem ließen die Massenspektren den Schluss zu, dass die nachträgliche UV-induzierte Funktionalisierung tatsächlich nur an der Oberfläche des Gerüsts stattfand.
Darüber hinaus gelang es den Forschern, die reaktiven Gruppen auf der Gerüstoberfläche auch mit fluoreszierenden Farbstoffmolekülen oder Proteinen zu funktionalisieren und diese mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop darzustellen.
Fazit: Die Designer-Petrischalen des Karlsruher Trios sind recht einfach herzustellen und eignen sich perfekt als Scaffolds für die 3D-Zellkultur – was will man als 3D-Zellkultivierer mehr?
Irene Doering